Nova ferramenta de edição de RNA pode melhorar o tratamento do câncer

O sistema de edição genética CRISPR-Cas9 é excelente em alterar e reprimir genes. Mas as mudanças que faz são permanentes, o que pode ser um grande problema se o sistema falhar.

Um sistema baseado em CRISPR que tenha como alvo o RNA mensageiro de curta duração de uma célula¹ em vez do DNA poderia fornecer uma forma mais precisa e reversível de conceber terapias celulares – e até ajudar os cientistas a descobrir como diferentes genes funcionam em conjunto.

Em um novo estudo, publicado na revista Cell, pesquisadores da Universidade de Stanford apontam que uma plataforma CRISPR direcionada ao RNA, que chamaram de Multiplexed Effector Guide Arrays, ou MEGA, pode ajustar o metabolismo² das células³ imunológicas sem alterações genéticas permanentes, dando nova vida às células³ CAR-T exauridas e assim aumentando seu poder de combater o câncer⁴.

A descoberta revela potencialmente uma maneira, de risco relativamente baixo, de aprimorar as terapias celulares existentes para o câncer⁴.

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O autor principal e estudante de pós-graduação de Stanford, Victor Tieu, estava interessado em melhorar a terapia com células³ T com receptor de antígeno⁵ quimérico (CAR). Neste tratamento contra o câncer⁴, as células³ T – um tipo de glóbulo branco – são projetadas com a proteína CAR, um receptor que permite às células³ rastrear melhor as células³ cancerígenas. Embora a terapia CAR-T tenha tratado com sucesso cânceres do sangue⁶, incluindo linfomas e mieloma⁷ múltiplo, as células³ imunológicas projetadas não se comportaram bem contra cânceres sólidos, como câncer⁴ de pâncreas⁸ e de pulmão⁹.

Isto porque os tumores sólidos têm uma estrutura mais volumosa para as células³ imunológicas penetrarem – as células³ ficam exaustas antes de poderem avançar na destruição dos tumores. As células³ T evoluíram para disparar rapidamente e atacar vírus¹⁰, o que significa que muitas vezes esgotam as suas reservas de energia demasiado cedo quando lutam contra o câncer⁴. “Estávamos realmente interessados em saber como podemos aprimorar essas células³ para melhorar os resultados clínicos”, disse Tieu. “Muitas das ferramentas que temos agora simplesmente não são tão boas.”

Os pesquisadores testaram sua ferramenta em células³ CAR-T em culturas de laboratório com células³ tumorais e em camundongos com câncer⁴. “Nossa descoberta é que ela tem um desempenho 10 vezes melhor, em termos de redução do crescimento do tumor¹¹ e em termos de sustentação da proliferação de células³ T a longo prazo”, disse o autor sênior¹² Stanley Qi¹³, professor associado de bioengenharia de Stanford e acadêmico do instituto Sarafan ChEM-H.

Esforços de pesquisa anteriores para melhorar a terapia com células³ CAR-T usaram CRISPR-Cas9 para editar o DNA das células³. No entanto, esta plataforma de edição genética apresenta riscos porque elimina permanentemente pedaços de DNA, o que pode ter consequências indesejadas e até fazer com que as próprias células³ T se tornem cancerígenas.

Assim, a equipe de Stanford seguiu um caminho diferente, explorando se o CRISPR-Cas13d – que utiliza uma tesoura molecular que corta o RNA, e não o DNA – poderia permitir alterações reversíveis na expressão genética nas células³ T. Ao contrário do Cas9, o Cas13d pode facilmente atingir vários genes ao mesmo tempo – no artigo, os pesquisadores demonstraram que poderiam fazer 10 edições de uma vez em células³ T humanas. “O RNA é a próxima camada acima do DNA, então não estamos realmente tocando em nenhum código genético”, disse Tieu. “Mas ainda conseguimos grandes mudanças na expressão genética que são capazes de alterar o comportamento da célula¹.”

Para ver se esta ferramenta poderia melhorar com sucesso a função das células³ CAR-T, eles identificaram 24 genes que poderiam estar envolvidos na exaustão das células³ T. Eles então testaram 6.400 combinações de genes pareados em cultura, com diferentes genes sendo desligados usando a ferramenta MEGA, e identificaram novos pares de genes que funcionaram especialmente bem juntos para aumentar a função antitumoral.

Em outra experiência, a equipe ajustou um conjunto de genes metabólicos nas células³ T para alterar as células³ de ‘velocistas’ para ‘corredoras de maratona’, dando-lhes a resistência necessária para destruir os tumores. Eles compararam essas células³ CAR-T MEGA com células³ T não modificadas e células³ CAR-T, tanto em culturas de laboratório com células³ tumorais quanto em camundongos com câncer⁴. Após três semanas, eles testaram a extensão dos tumores e também como as células³ T sobreviviam.

No início, as células³ MEGA ficaram para trás na sua atividade anticancerígena. “Inicialmente, pensei: ‘Ah, essas células³ são piores’”, disse Tieu. Mas, depois de algum tempo, estas células³ perseveraram contra as células³ tumorais enquanto as células³ CAR-T e as células³ T normais se desgastaram, levando a uma melhoria de 10 vezes na redução do crescimento tumoral e na proliferação de células³ T.

O segredo foi mudar a forma como as células³ gastavam seu açúcar¹⁴, afastando-se de um processo de glicólise de queima rápida e favorecendo a fosforilação oxidativa. “Fomos capazes de usar esta tecnologia para alterar os RNAs mensageiros nesta via de utilização do açúcar¹⁴ dentro das células³ T que regulam a escolha de qual molécula de açúcar¹⁴ usar”, disse Qi¹³. Como resultado, “fomos capazes de realmente sustentar a persistência dessas células³ T, para que as células³ T pudessem viver mais tempo no local do tumor¹¹ e também exercer um desempenho muito melhor”.

A plataforma MEGA não apenas permitiu o ajuste fino dos genes que regulam o metabolismo² das células³ T, mas o ajuste também poderia ser regulado com um medicamento. Quando um antibiótico chamado trimetoprima estava presente, ele ativava as alterações no RNA, reprimindo o metabolismo² da glicólise das células³ e transformando-as em atletas de resistência no ataque às células³ tumorais. Quando o medicamento acabou, as células³ voltaram à expressão genética original. Este mecanismo de controle baseado em medicamentos “permite criar um interruptor de segurança” para tratamentos de imunoterapia, disse a co-autora Crystal Mackall, professora de pediatria e medicina em Stanford.

Embora a plataforma ainda esteja em seus estágios iniciais, os pesquisadores esperam que ela possa eventualmente ser útil em ambientes clínicos. Tieu planeja continuar o desenvolvimento da plataforma visando esse objetivo. “Seria muito legal tentar transformar isso em um produto clínico real”, disse ele. “Acho que há muito potencial para realmente melhorar a terapia com células³ CAR-T de uma forma que as pessoas não poderiam ter feito antes.”

Leia sobre "Conhecendo o sistema imunológico¹⁵" e "Genética - conceitos básicos".

Confira a seguir o resumo do artigo publicado.

Uma plataforma CRISPR-Cas13d versátil para regulação transcriptômica multiplexada e engenharia metabólica em células³ T humanas primárias

Destaques

• MEGA permite inativação de RNA massivamente multiplexada em células³ T humanas primárias
• Triagem combinatória da inativação identifica reguladores pareados da função das células³ CAR-T
• Regulação multigênica ajustável e reversível com um medicamento aprovado pela FDA
• A engenharia metabólica melhora a aptidão das células³ CAR-T e a atividade antitumoral in vivo

Resumo

As tecnologias CRISPR começaram a revolucionar as terapias com células³ T; no entanto, as ferramentas convencionais de edição genética CRISPR-Cas9 são limitadas em sua segurança, eficácia e escopo.

Para enfrentar esses desafios, desenvolveu-se matrizes de guias efetoras multiplexadas (em inglês, multiplexed effector guide arrays, MEGA), uma plataforma para regulação programável e escalonável do transcriptoma de células³ T usando a atividade de CRISPR-Cas13d direcionada a RNA e guiada por RNA.

MEGA permite inativação quantitativa, reversível e massivamente multiplexada de genes em células³ T humanas primárias sem ter como alvo ou cortar o DNA genômico.

Aplicando MEGA a um modelo de exaustão de células³ CAR-T, suprimiu-se de forma robusta a regulação positiva do receptor inibitório e descobriu-se reguladores pareados da função das células³ T através da triagem CRISPR combinatória.

Além disso, implementou-se a regulação por medicamento da MEGA para controlar a ativação do CAR de maneira independente do receptor.

Por último, MEGA permitiu a repressão multiplexada das vias metabólicas imunorreguladoras para melhorar a aptidão das células³ CAR-T e a atividade antitumoral in vitro e in vivo.

A plataforma MEGA oferece um kit de ferramentas sintético versátil para aplicações em imunoterapia contra o câncer⁴ e além.

Fontes:
Cell, Vol. 187, Nº 5, em fevereiro de 2024.
Stanford News, notícia publicada em 21 de fevereiro de 2024.